培養基是細胞培養中*的營養成分,但是基礎的培養基卻給實驗者帶來了一系列的問題。
別小看細胞培養,這里可蘊含著大學問。
1.怎樣查到一個特定細胞株的相關知識和培養條件?
ATCC(American Type Culture Collection)收集了絕大多數細胞的詳細資料。打開ATCC網頁的Cells and hybridomas鏈接,輸入細胞名稱就可以搜索ATCC的細胞數據庫。數據庫中有每一種細胞的詳細描述,包括細胞的來源,培養和凍存條件,以及相關文獻等資料。
2.如何選用特殊細胞系培養基?
培養某類型細胞沒有固定的培養條件。MEM中培養的細胞,很可能在DMEM或M199中同樣容易生長??傊?,首-選MEM、DMEM做貼壁細胞培養;RPMI1640做懸浮細胞培養;
新的細胞培養時要詳查資料。
3.自己新配制的液體培養基能保存多久?
我們建議將新配制的培養基放置于4℃,避光保存盡量在一周內使用完畢,培養基越新鮮越好。
4.培養基中添加了血清和抗生素后,可長期保存嗎?
一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時,您應該在一到兩周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。
5.培養基中是否須添加抗生素?
除了特殊篩選系統外,一般正常培養狀態下,培養基中不應添加任何抗生素。
為防止細菌、真菌污染,可以加入青霉素-鏈霉素雙抗溶液,其培養基中的終濃度為青霉素100U/ml,鏈霉素為100ug/ml,但是不建議長期使用。
6.液體培養基可以放-20℃保存嗎?
不可以!因為在-20℃下,培養基中的鹽容易析出,培養基融化后,有的鹽可能無法重新溶解,從而導致培養基滲透壓降低,培養細胞時,細胞容易破裂而死亡。
7.為何培養基保存于4℃冰箱中,顏色會偏暗紅色,且pH值越來越偏堿性?
培養基保存于4℃冰箱中, 培養基內之CO2 會逐漸溢出,造成培養基越來越偏堿性。而培養基中的酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果, 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時, 可以通入無菌過濾的CO2, 以調整pH 值。
8.為什么液體培養基1640顏色發黃,是pH值不對嗎?
不是。因為配方原因,1640為減酚紅型,其中酚紅的濃度只有DMEM的四分之一,所以是因為酚紅濃度低,而非PH值低。
9.培養液pH是怎樣影響細胞生長的?
由于大多數細胞適宜PH值為7.2-7.4,偏離此范圍對細胞將產生有害的影響。各種細胞對PH值要求也不*相同,原代細胞培養一般對PH值變動耐受差,無限細胞系耐受力強。
但總體來說,細胞耐酸性比耐堿性強一些,偏酸環境中更有利于細胞的生長。因此,配制培養用液時可把液體的PH值稍微調的偏酸一些。液體在經過0.1um或0.2um濾膜過濾時,PH值會向上浮動0.2左右。
10.培養液滲透壓是怎樣影響細胞生長的?
當細胞內、外環境的分子濃度不同時就會產生滲透壓。這種情況下,水分通過滲透流入或流出細胞,從而改變細胞的內環境。
高滲透壓迫使水分從細胞中擴散出來導致細胞收縮,這種情況會使DNA和蛋白遭到破壞,細胞周期停滯以及終使細胞死亡;反之,低滲透壓使水分流入細胞內,使細胞腫脹破裂。
11.為什么有客戶要求培養基中不含酚紅?
研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用(特別是雌激素)。為避免固醇類反應,細胞培養,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加酚紅的培養基。
12.酚紅的作用是什么?
酚紅在培養基中被用來作為PH值指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。
13.干粉培養基里含NaHCO3嗎?
所有的干粉培養基中都不含NaHCO3 。
請依據說明書或包裝袋上的標注,在干粉培養基*溶解后添加NaHCO3 。
14.NaHCO3的作用是什么?
與CO2一起形成緩沖系統,保持培養基PH值穩定。
15.我們實驗室培養箱CO2濃度一直以來都是5%,這樣可以嗎?
當然不可以,不同的培養基要求添加NaHCO3的量不一樣,如DMEM要求添加3.7g/L,為了保持PH值穩定,必須用高濃度的CO2平衡,一般不低于8%,而1640等要求添加NaHCO3 2.2g/L,還有些培養基要求添加更少,那么這些培養基就要求較低的濃度平衡,一般是5%。
16.培養基中丙-酮酸鈉的作用是什么?
丙-酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源,盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是如果沒有葡萄糖的話,細胞也可以代謝丙-酮酸鈉。
丙-酮酸鈉的貯存液濃度一般為50mM,-20℃保存,培養基中的終濃度為1mM.
17.谷氨酰胺的作用是什么?
幾乎所有的細胞對谷氨酰胺都有較高的要求。谷氨酰胺脫掉氨基后,可作為培養細胞的能量來源,參與蛋白質的合成和能量代謝。在缺少谷氨酰胺時,細胞生長不良而死亡。所以,各種培養液中都含有較大量的谷氨酰胺。
谷氨酰胺在溶液中很不穩定,應置-20℃冰凍保存,用前加入培養基中。加有谷氨酰胺的液體培養基4度冰箱儲存兩周以上時,應重新加入原來量的谷氨酰胺。
18.在培養基中加入HEPES有何好處?
培養基中-常用的Buffer system是碳酸氫鹽,它可提供營養,但卻在生理PH值條件下會降低緩沖能力。而HEPES是一種很強的Buffer,加入HEPES能使細胞培養基在PH7.2-7.6條件下緩沖能力增強。
Hepes的貯存液濃度一般為1M,常溫保存。培養基中的終濃度為25mM,即5ml 1M的Hepes加入到200ml*培養基中。
19.GlutaMAX-Ⅰ是什么?培養細胞如何利用GlutaMAX-Ⅰ?這個二肽有多穩定?
GlutaMAX-Ⅰ是一個L-谷氨酰胺的衍生物,其不穩定的a-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-Ⅰ二肽非常穩定,即使在121℃滅菌20min, GlutaMAX-Ⅰ二肽溶液有小的降解;而在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎*降解。
L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的,但其在溶液中不穩定,經過一段時間后會降解,確切的降解率一直沒有終確定。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成,而氨對于一些細胞具有毒性。因此GlutaMAX-Ⅰ是細胞培養中谷氨酰胺的替代品。
20.可否使用與原先培養條件不同的培養基?
不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基,若驟然使用和原先提供之培養條件不同的培養基,細胞大多無法立即適應,造成細胞無法存活。
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